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　　在實(shí)驗(yàn)中如何收集樣品，使樣品聚集或分離？今天可成就向大家介紹離心機(jī)的操作使用。

　　離心技術(shù)

　　離心技術(shù)是利用物體高速旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，使置于旋轉(zhuǎn)體中的懸浮顆粒發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒達(dá)到濃縮或與其他顆粒分離之目的。離心技術(shù)是蛋白質(zhì)、酶、核酸及細(xì)胞亞組分分離的最常用的方法之一，也是生化實(shí)驗(yàn)室中常用的分離、純化或澄清的方法。這里的懸浮顆粒往往是指制成懸浮狀態(tài)的細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒和生物大分子等。離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時(shí)，當(dāng)懸浮顆粒密度大于周?chē)橘|(zhì)密度時(shí)，顆粒離開(kāi)軸心方向移動(dòng)，發(fā)生沉降；如果顆粒密度低于周?chē)橘|(zhì)的密度時(shí)，則顆粒朝向軸心方向移動(dòng)而發(fā)生漂浮。

　　離心原理

　　將樣品放入離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的離心管內(nèi)，離心機(jī)驅(qū)動(dòng)時(shí)，樣品液就隨離心管做勻速圓周運(yùn)動(dòng)，于是就產(chǎn)生了一向外的離心力。由于不同顆粒的質(zhì)量、密度、大小及形狀等彼此各不相同，在同一固定大小的離心場(chǎng)中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互間的分離。

　　離心力

　　溶液中的固相顆粒做圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生一個(gè)向外離心力，其定義為：

　　F = mω2r

　　公式中：

　　F 為離心力的強(qiáng)度； m 為沉降顆粒的有效質(zhì)量；

　　ω 為離心轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)動(dòng)的角速度，其單位為rad/s；

　　r 為離心半徑(cm)，即轉(zhuǎn)子中心軸到沉降顆粒之間的距離。

　　很顯然，離心力隨著轉(zhuǎn)速和顆粒質(zhì)量的提高而加大，而隨著離心半徑的減小而降低。離心力通常以相對(duì)離心力Fcf 表示，即離心力F 的大小相對(duì)于地球引力(G)的多少倍，單位為g,其計(jì)算公式如下：

　　Fcf = 1.119×105(h)2r×g

　　可以看出，在同一轉(zhuǎn)速下，由于f 的不同，F(xiàn)cf相差會(huì)很大，實(shí)際應(yīng)用時(shí)一般取平均值。在離心實(shí)驗(yàn)的報(bào)告中，F(xiàn)cf、r 平均、離心時(shí)間t 和液相介質(zhì)等條件都應(yīng)表示出來(lái)，因?yàn)樗鼈兌寂c樣品的沉降速度有直接的聯(lián)系。顯然Fcf是一個(gè)只與離心機(jī)相關(guān)的參數(shù)，而與樣品并無(wú)直接的關(guān)系。

　　速度與系數(shù)

　　一個(gè)顆粒要沉降，它必須置換出位于它下方等體積的溶液，這只有當(dāng)顆粒的質(zhì)量大于被置換出的液體的質(zhì)量時(shí)才能通過(guò)離心的手段達(dá)到，否則，在離心過(guò)程中顆粒將發(fā)生向上漂浮，而不是下沉。當(dāng)顆粒在運(yùn)動(dòng)時(shí)，不論方向如何，它都要穿過(guò)溶劑分子，所產(chǎn)生的摩擦力總是與顆粒運(yùn)動(dòng)的方向相反。

　　摩擦力的大小與顆粒的運(yùn)動(dòng)速度成正比，并且受顆粒的大小、形狀及介質(zhì)性質(zhì)的影響：式中：

　　f為顆粒在濟(jì)劑中的摩擦系數(shù)．與顆粒的大小、形狀及介質(zhì)性質(zhì)相關(guān)；

　　v為顆粒的沉降速度。

　　由于離心力的存在，顆粒將加速運(yùn)動(dòng)直到摩擦力與離心力相等。在這種情況下，顆粒所受到的凈作用力為零，顆粒將以最大速度運(yùn)動(dòng)。

　　式中 Mp 和M s 分別為顆粒的質(zhì)量及等體積的溶劑的質(zhì)量。

　　上式中的Mp 和M s 很難確定，為了建立分子大小與沉降系數(shù)之間的關(guān)系，引入了沉降系數(shù)這一新的概念。沉降系數(shù)定義為沉降速度與離心力的比率或單位離心場(chǎng)中顆粒的沉降速度，它以svedberg單位計(jì)算，1S=1×10-13 s.例如，核糖核酸酶A 的沉降系數(shù)為1．85×10-13 s,即可記作1．85S.

　　近年來(lái)，在生物化學(xué)、分子生物學(xué)及生物工程等書(shū)刊文獻(xiàn)中，對(duì)于某些大分子化合物，當(dāng)它們的詳細(xì)結(jié)構(gòu)和分子量不很清楚時(shí)，常常用沉降系數(shù)這個(gè)概念去描述它們的大小。如核糖體RNA(rRNA)有30s亞基和50s亞基，這里的s就是沉降系數(shù)，現(xiàn)在多地用于生物大分子的分類，特別是核酸。

　　離心力與轉(zhuǎn)速的換算

　　轉(zhuǎn)速與離心力換算公式：

　　Rcf=1.118×（10-5）×r×[rpm]2

　　Rcf為離心力，一般以g（重力加速度）的倍數(shù)來(lái)表示；

　　rpm為轉(zhuǎn)速，單位為轉(zhuǎn)/分

　　r為半徑，單位為厘米。

　　離心分離應(yīng)用

　　離心分離是通過(guò)離心機(jī)的高速運(yùn)轉(zhuǎn)，使離心加速度超過(guò)重力加速度的成百上千倍，而使沉降速度增加，以加速液體中雜質(zhì)沉淀并除去的一種方法。其原理是利用混合液密度差來(lái)分離料液，比較適合于分離含難于沉降過(guò)濾的細(xì)微粒或絮狀物的懸浮液。

　　沉淀離心法

　　沉淀離心是分離懸濁液中的溶液和不溶性顆粒時(shí)，對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單、快速的離心分離，以代替耗時(shí)的過(guò)濾操作。

　　沉淀離心通常使用固定的轉(zhuǎn)速(即離心力)，離心一定時(shí)間以達(dá)到分離的目的。沉淀離心中離心機(jī)轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)子半徑及離心時(shí)間是決定分離效果的主要因素。離心沉淀樣品所需時(shí)間取決于樣品的沉降系數(shù)(s值)，沉降系數(shù)s的物理學(xué)意義是單位離心力作用下樣品的沉降速度。故沉降系數(shù)s越大，顆粒沉降越快，所需時(shí)間越短，反之亦然。

　　沉淀離心法是從懸濁液或乳濁液中分離樣品最常用的一種方法，主要用于去除溶液中懸浮的雜質(zhì)，或通過(guò)離心沉淀收集懸浮于溶液中的顆粒物質(zhì)。

　　差速離心法

　　差速離心是根據(jù)顆粒大小和密度不同造成沉降速度(即沉降系數(shù))的差異，通過(guò)分級(jí)提高離心轉(zhuǎn)速或高速與低速離心交替進(jìn)行，使具有不同質(zhì)量的顆粒樣品(或大分子)從混合液中分批沉降至管底，從而實(shí)現(xiàn)分離目的。

　　該方法適用于混合樣品中各沉降系數(shù)差別較大的組分之間的分離，更準(zhǔn)確地說(shuō)是沉降系數(shù)差別在1至幾個(gè)數(shù)量級(jí)的混合樣品的分離，差別越大，分離效果越好。

　　差速離心法一般采用固定角轉(zhuǎn)子，通過(guò)較低速度的離心沉淀，最重的顆粒將全部沉到管底。繼續(xù)將上清液以更高的轉(zhuǎn)速沉淀，即可得到次重的顆粒樣品。逐步增加離心轉(zhuǎn)速，即可分別得到不同重量的樣品顆粒，以達(dá)到分離的目的。但以上只是理想狀態(tài)，通常每步得到的沉淀并不均一，通常會(huì)混有較輕的顆粒。這是因?yàn)樵陔x心前各種重量的顆粒均勻分布在溶液中，當(dāng)開(kāi)始離心后，所有顆粒都依照自身的沉降速度向管底移動(dòng)，所以距離管底較近的輕顆粒也會(huì)沉到管底而混合到重顆粒之中。通常為了得到較純的顆粒樣品，還需要將沉淀重懸，用相同的轉(zhuǎn)速再次沉淀。重復(fù)幾次之后即可得到大小基本均一的顆粒。但是一般在實(shí)際使用中，差速離心通常不用于精細(xì)分離。僅用于s值相差1個(gè)數(shù)量級(jí)及以上的2種顆粒的分離，且沉淀不能實(shí)現(xiàn)完全回收。

　　差速離心技術(shù)的應(yīng)用十分普遍，尤其是針對(duì)有生物活性的物質(zhì)，如動(dòng)植物病毒、各種亞細(xì)胞組分(細(xì)胞核、葉綠體、線粒體等)，以及核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的分離、粗提和濃縮。

　　梯度離心法

　　密度梯度離心法是使待分離樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，最終分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法，又稱區(qū)帶離心。

　　密度梯度離心不僅可依據(jù)樣品顆粒的重量及沉降系數(shù)進(jìn)行分離，還可根據(jù)樣品顆粒的密度、形狀等特征進(jìn)行分離。密度梯度離心在整個(gè)離心過(guò)程中只使用一種轉(zhuǎn)速，中途無(wú)需變更實(shí)驗(yàn)參數(shù)，而差速離心則需要進(jìn)行調(diào)整轉(zhuǎn)速、重懸反復(fù)離心等操作。密度梯度離心適宜分離密度有一定差異的樣品，而差速離心則適用于分離混合樣品中各沉降系數(shù)差別較大的組分。

　　密度梯度離心的優(yōu)點(diǎn)是：分離效果好，可一次性獲得較純的樣品顆粒；適應(yīng)范圍廣，既可像差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差異的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；顆粒會(huì)懸浮在相應(yīng)的位置上形成區(qū)帶，而不會(huì)形成沉淀被擠壓變形，故能最大限度保持樣品的生物活性；樣品處理量大，且可同時(shí)處理多個(gè)樣品；對(duì)溫度變化及加減速引起的擾動(dòng)不敏感。密度梯度離心法的缺點(diǎn)是：離心時(shí)間長(zhǎng)、需制備密度梯度介質(zhì)溶液、對(duì)操作者的技能要求較高。密度梯度離心法通常采用吊桶式的水平轉(zhuǎn)子、區(qū)帶轉(zhuǎn)子及近垂直轉(zhuǎn)子。

　　離心前，離心管內(nèi)先裝入分離介質(zhì)（如蔗糖、甘油等），使形成連續(xù)的或不連續(xù)的密度梯度介質(zhì)，然后加入樣品進(jìn)行離心，具體又可分為：

　　速度區(qū)帶

　　離心前，離心管內(nèi)先裝入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介質(zhì)，待分離樣品鋪在梯度液的頂部，離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心，利用各顆粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具有不同沉降速度的顆粒處于不同密度的梯度層內(nèi)，達(dá)到彼此分離的目的。本法可分離各種細(xì)胞、病毒、染色體、脂蛋白、DNA和RNA等生物樣品。

　　預(yù)制梯度

　　要求在離心前預(yù)先配制管底濃而管頂稀的密度梯度介質(zhì)，常用介質(zhì)有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等，待分離樣品一般鋪在梯度液頂上，如需挾在梯度液中間或管底部，則需調(diào)節(jié)樣品液密度。離心后，不同密度的樣品顆粒到達(dá)與自身密度相等的梯度層，即達(dá)到等密度的位置而獲得分離。

　　自成梯度

　　某些密度介質(zhì)經(jīng)過(guò)離心后會(huì)自成梯度，例Percoll,可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間離心后也可產(chǎn)生穩(wěn)定的梯度。需要離心分離的樣品可和梯度介質(zhì)先均勻混合，離心開(kāi)始后，梯度介質(zhì)由于離心力的作用逐漸形成管底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時(shí)，可以帶動(dòng)原來(lái)混合的樣品顆粒也發(fā)生重新分布，到達(dá)與其自身密度相等的梯度層里，即達(dá)到等密度的位置而獲得分離。

　　離心工具—離心機(jī)

　　離心機(jī)是利用離心力，分離液體與固體顆?；蛞后w與液體的混合物中各組分的機(jī)械。離心機(jī)主要用于將懸浮液中的固體顆粒與液體分開(kāi)，或?qū)⑷闈嵋褐袃煞N密度不同，又互不相溶的液體分開(kāi)；它也可用于排除濕固體中的液體；特殊的超速管式分離機(jī)還可分離不同密度的氣體混合物；利用不同密度或粒度的固體顆粒在液體中沉降速度不同的特點(diǎn)，有的沉降離心機(jī)還可對(duì)固體顆粒按密度或粒度進(jìn)行分級(jí)。

　　小型離心機(jī)

　　小型離心機(jī)一般不可調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)速和離心溫度，打開(kāi)開(kāi)關(guān)即可離心，關(guān)閉開(kāi)關(guān)即可停止離心（部分小型離心機(jī)為開(kāi)蓋自動(dòng)離心，關(guān)蓋自動(dòng)停止離心），小型離心機(jī)一般為固定轉(zhuǎn)速低速離心，離心轉(zhuǎn)速一般為100~10000轉(zhuǎn)/分，相對(duì)離心力可達(dá)0.1~10kg,根據(jù)小型離心機(jī)的轉(zhuǎn)子不同可以離心0.2mL、0.5mL、1.5mL、2.0mL、0.2mL、0.2mL-8連排離心管和0.2mL-96孔反應(yīng)板。

　　中型離心機(jī)

　　中型離心機(jī)一般可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)速，開(kāi)始、結(jié)束離心和開(kāi)蓋通過(guò)按鈕控制，不可調(diào)節(jié)離心溫度，離心轉(zhuǎn)速、離心時(shí)間和變速時(shí)加減速度通過(guò)操作面板進(jìn)行調(diào)節(jié)，離心轉(zhuǎn)速一般為100~15000轉(zhuǎn)/分，相對(duì)離心力可達(dá)0.1~20kg,根據(jù)中型離心機(jī)的轉(zhuǎn)子不同可以離心1.5mL、2.0mL和5mL離心管。

　　大型離心機(jī)

　　大型離心機(jī)一般可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)速和離心溫度，開(kāi)始、結(jié)束離心和開(kāi)蓋通過(guò)按鈕控制，離心轉(zhuǎn)速、離心時(shí)間、變速時(shí)加減速度和離心溫度通過(guò)操作面板進(jìn)行調(diào)節(jié)，離心溫度調(diào)節(jié)范圍為0℃~室溫，離心轉(zhuǎn)速一般為100~20000轉(zhuǎn)/分，相對(duì)離心力可達(dá)0.1~30kg,根據(jù)中型離心機(jī)的轉(zhuǎn)子不同可以離心1.5mL、2.0mL、5mL、15mL、50mL離心管和250mL錐形瓶。

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